陈谦1 张新雄2** 赵海1 官家发1**
（1中国科学院成都生物研究所 成都 610041）
（2东莞市保得生物工程有限公司 广东东莞 523087）
摘要：综述了近年来国内外对生物有机肥中几种主要功能微生物的研究及应用概况. 总结了生物有机肥中的芽孢杆菌，假单胞菌，链霉菌以及其它一些功能菌在抑制作物病原菌、溶解土壤中难溶养份、产生作物生长调节因子等方面发挥的巨大作用. 指出含有功能微生物是生物有机肥的重要特征. 概述了生物有机肥的安全性问题. 对我国生物有机肥研制应用现状中存在的问题及发展前景进行了讨论并提出加强高效功能菌株的选育和肥料生产技术的完善是提高生物有机肥肥效的重要途径. 参85
关键词：生物有机肥；功能菌；芽孢杆菌；假单胞菌；链霉菌；安全性
CLC S144. 1
Advances in Study and Application of Some Functional Microbes in Bio-organic Fertilizer*
CHEN Qian1, ZHANG Xinxiong2**, ZHAO Hai1 & GUAN Jianfa1**
(1Chengdu Institute of Biology, Chinese Academy of Science, Chengdu 610041, China)
(2Dongguan Baode Biological Engineering Co., Ltd., Dongguan 523087, Guangdong, China)
Abstract The recent study and application of some functional microbes in bio-organic fertilizer were reviewed. The effects of Bacillus, Pseudomonas, Streptomycete and other functional microbes in bio-organic fertilizer were summarized. Bacillus, a kind of widely applied, environment-friendly and high security microorganism, could strongly inhibit many field crops’ pathogens and pests and effectively degrade phosphate pesticide. Disease resistance of field crop could be induced by Pseudomonas. Many crops’ pathogens were inhibited by Streptomycete and crops yields were increased. Other functional microbes also displayed their special effects in bio-organic fertilizer. Containing these functional microbes was the most significant characteristics of bio-organic fertilizer comparing with other fertilizers. The biological safety problem of bio-organic fertilizer was reviewed and it needed to be paid much attention in future. The problems of development and application of bio-organic fertilizer in China were discussed. Screening much effective functional microbes and improving producing technique were considered to be an important way to improve fertility of bio-organic fertilizer. Ref 85
Keywords bio-organic fertilizer; functional microbe; Bacillus; Pseudomonas; Streptomycete; safety.
CLC S144. 1
资源和环境问题是当今人类最为重视的问题之一，由于近年来化肥及农药的大量使用，造成农产品质量下降，土壤品质和生产力降低，农业生产环境恶化，河流和地下水污染严重等一系列问题. 为保障粮食供应及农产品质量安全和良好的农业生产环境，我国农业必须走可持续发展道路，寻找传统化肥的替代品成为目前研究的热点之一[1,2]. 生物有机肥是指特定功能微生物与主要以动植物残体（如畜禽粪便、农作物秸秆等）为来源并经无害化处理、腐熟的有机物料复合而成的一类兼具微生物肥料和有机肥效应的肥料[3]. 其本质特征是含有特定功能的，表现出一定的肥料效应的微生物，这些功能微生物的生命活动是生物有机肥优于其它肥料的关键因素[4]. 生物有机肥施用后能产生多种活性物质活化土壤中难溶化合物以提高土壤肥力并有利于农作物吸收养份；产生抑菌物质和生长调节因子减少作物病虫害的发生并促进作物稳健生长[5]. 生物有机肥的种种优点已受到越来越广泛的关注. 本文对近年来生物有机肥中起主要作用的微生物的功能、它们之间相互作用及其对生物有机肥施用效果的影响等研究进行综述，以期为我国生物有机肥的研制、生产和施用提供参考.
1 生物有机肥中主要的功能微生物及其对作物的影响
单一菌种、单一功能的生物有机肥已不能满足现代农业发展的要求. 目前，复合菌种是生物有机肥的发展趋势[6]. 在生物有机肥生产过程中，加入的功能菌一般为芽孢杆菌（Bacillus）、假单胞菌（Pseudomonas）、链霉菌（Streptomycete）、固氮菌、溶磷菌、光合细菌等[7].
1. 1 芽孢杆菌
芽孢杆菌是一大类广泛分布于自然界，细胞呈直杆状，鞭毛周生，多数能运动，能形成内生芽孢，革兰氏阳性或生命早期呈革兰氏阳性，严格好氧或兼性厌氧的化能异养细菌[8,9]. 2004年出版的第9版《伯杰氏细菌系统学手册：原核生物分类纲要》将芽孢杆菌类细菌分为35个属，共计409种. 芽孢杆菌能产生多种抗生素、酶类等活性物质，广泛应用于饲料加工、医药、农药、食品等各个行业[10]，如工业上耐高温的α-淀粉酶主要由地衣芽孢杆菌发酵产生[11]；洗涤添加剂碱性纤维素酶主要由嗜碱芽孢杆菌产生[12]；苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）的伴胞晶体是农业上常用的杀虫剂[13]. 另外，芽孢杆菌在医学上也展现出良好的应用前景[14,15]. 其中应用广泛且比较重要的是：地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、侧胞芽孢杆菌（Brevibacillus laterosporus）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）等.
1. 1. 1 地衣芽孢杆菌
地衣芽孢杆菌是一种安全性高、生长迅速、抗逆性强的工业微生物菌种，在酶制剂生产、饲料加工、医学、生物农药等方面得到了广泛的应用[11,16,17]，我国农业部发布的《饲料添加剂品种目录（2006）》将地衣芽孢杆菌列入安全饲料添加剂.
长期以来人们主要依赖于多菌灵、万霉灵和速克灵等化学农药来防治植物 病害[18]. 而化学农药的持续施用使病原菌快速产生抗药性，农药的防治效果明显下降，同时还污染农业生产环境. 地衣芽孢杆菌分泌的多种蛋白类抗菌物质（几丁质酶、抗菌蛋白、多肽类）可有效抑制一些植物病原菌的生长[19]，减少有机农药的施用.
Kim等分离到一株地衣芽孢杆菌B65-1，其分泌的苯乙酸类抗生素能明显抑制动物病原菌金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、藤黄色微球菌（Micrococcus luteus）、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）、化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）、绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）和白色念珠菌（Candida albicans）的生长[20].
Sid等从辣椒根际分离的四株地衣芽孢杆菌HS93，LS234，LS523和LS674对辣椒疫霉病（Phytophthora capsici）的抑制率分别达到80%，51%，49%和54%；对辣椒黑斑病（Alternaria alternata）分别达到54%，74%，62%和53%. 盆栽实验表明，用这四株菌的菌悬液浸泡过的辣椒种子播种后，辣椒疫霉病和黑斑病的发病率明显降低，且添加0. 5%的几丁质能提高LS674对上述辣椒病害的抑制效果[21].
灰霉病（Botrytis cinerea Pers.）是严重危害番茄等作物生产的病害之一. 童蕴慧等报道地衣芽孢杆菌W10对番茄灰霉病的田间防除率达到70%，并可诱导番茄植株产生灰霉病抗性[22]. W10还对苹果轮纹病菌（Physalospora piricola）、柑橘炭疽病菌（Colletotrichum glecosporioides）和青霉病菌（Penicilliosis italicum）具有明显的抑制作用[23]. 地衣芽孢杆菌在防治烟草黑胫病（Phytophthora nicotianae）[24]、棉花黄萎病（Verticillium dahliae）[25]、水稻稻瘟病（Magnaporthe grisea）[26]等方面也表现出明显的效果.
燕红等的研究表明，地衣芽孢杆菌可产生半纤维素酶、纤维素酶和木质素酶降解农业废弃物——秸秆，发酵5天后，纤维素降解率可达14. 91%[27]. 顾小平等从毛竹根系处分离到的四株地衣芽孢杆菌具有固氮特性，接种后可促进毛竹实生苗的生长并显著提高苗木的成活率[28].
华南农业大学的王振中等研制的地衣芽孢杆菌202能够有效抑制香蕉枯萎病菌的生长，环境安全性好，具有良好的开发前景[29].
1. 1. 2侧孢芽孢杆菌
侧孢芽孢杆菌广泛分布于自然界及某些动物体内，随着研究的深入，发现侧孢芽孢杆菌具有多种应用潜力，如产生杀虫、抑菌活性物质，具有解磷、解钾、固氮等多种功能[30].
张楹等分离到一株侧孢芽孢杆菌YMF3. 100003产生的一种胞外酶对两种危害严重的土传病原真菌——尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）和立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）菌丝的生长具有强烈的抑制作用[31].
有机磷农药是国内外应用最广泛的一类农药，但其毒性大，残留性高，对生态环境和人类健康产生严重的影响[30]. 宫占元等报道的侧孢芽孢杆菌BL-21和BL-22对有机磷农药水胺硫磷的解磷率分别达到58.98%和75.5%，对氧化乐果的解磷效率分别为32.66%和29.10%[32]；菌株BL-11和BL-12对无机磷的解磷能力分别达到10.91%和7.34%，可有效增加土壤中水溶性磷的含量，提高土壤品质[33]. Barsby等在巴布亚新几内亚分离到一株侧孢芽孢杆菌，其产生的一种十肽抗生素能明显抑制白色念珠菌的生长[34]. Orlova等报道一株侧孢芽孢杆菌形成的一种胞内晶体对幼蚊有毒杀作用[35]. 赵秋敏等分离到的一株产几丁质酶的侧孢芽孢杆菌1.864，对小麦赤霉菌（Fusarium graminearum）、棉花立枯菌（Rhizoctonia solani）、苹果轮纹菌等八株病原真菌有明显的抑制效果；对淡色库蚊二龄幼虫有明显的致死作用；且与Bt杀虫剂混合使用时对Bt杀虫剂有明显的增效作用[36]. 张新雄等发明了侧孢芽孢杆菌土壤接种剂，大田试验结果显示其主要功能为：1. 改良土壤，使土壤肥力、微生物活性及种群结构得到明显改善；2. 促进农作物生长，使农作物根系发达，植株增高，茎杆增粗，叶片增多增厚，叶色浓绿，生长稳健；3. 增强农作物抗病能力，农作物施用土壤接种剂后，均表现出抗病能力增强，被喻为“植物癌症”的烟草花叶病、棉花枯黄萎病，在施用接种剂后，发病率明显降低，大田病毒接种试验表明，烟草花叶病发病率降低60%~70%；4. 增强农作物抗寒能力和抗旱抗涝能力；5. 有效改善农产品品质；6. 提高农作物产量，土壤接种剂在不同地域，不同作物上应用，作物产量明显提高：蔬菜增产12%~30%，水果增产20%左右，水稻增产10%~15%，烟草增产7.5%~19.8%，茶叶鲜产量增收26.8%，蚕桑产量增加20.8%[37].
1. 1. 3枯草芽孢杆菌
枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌的模式菌株，在工农业、医药卫生、食品保健、水产养殖等方面具有较高的应用价值[38,39].
Cavaglieri等从玉米根围分离到枯草芽孢杆菌RC8、RC9和RC11对玉米轮状镰刀菌（Fusarium verticillioides）具有强烈的抑制作用，并抑制其伏马毒素B1的产生[40]. 枯草芽孢杆菌FZB-24在德国、美国等国已注册，并在德国Bayer公司投入生产，可用于防治番茄晚疫病、灰霉病和小麦白粉病，还可作为增产促进剂[41]. 近年来发现，枯草芽孢杆菌能产生与植物抗性蛋白合成基因表达相关的信号肽，诱导植物对病害产生抗性；或通过分泌如丝氨酸专一性肽链内切酶直接诱导植物产生抗性[42]. 如枯草芽孢杆菌AF1能诱导木豆种子中木豆丙氨酸解氨酶（PAL）的活性增加[42]；枯草芽孢杆菌IN937诱导黄瓜对嗜气管欧文菌产生抗性[43]. 另外，Bacillus subtilis FZB24 (r)可诱导大头菜生长出更为发达的根系，且FZB24 (r)液体培养物中存在植物生长素如细胞分裂素、玉米素、脱落酸、赤霉酸等，此培养物对萝卜或小麦根部处理或叶面喷施后对植株都表现出良好的生长促进作用[42]. 伊枯草菌素（iturin）是从枯草芽孢杆菌培养液中提取出来的一大类脂肽类化合物，包括伊枯草菌素A、B、C、D、E，芽孢菌素D、F、L及抗霉枯草菌素等，它们对多种植物病原菌具有很强的拮抗作用[44]. 枯草芽孢杆菌还能分泌植酸酶分解植酸，增加土壤中游离磷的含量，促进植物对磷的吸收[45].
除上述三种芽孢杆菌外，其它多种芽孢杆菌也有广泛的应用. 苏云金芽孢杆菌是目前应用广泛的微生物杀虫剂，它克服了传统化学农药污染环境、易使病原菌产生抗性等缺点，具有选择性强、安全、环境友好等优点[13]；程安春等分离到一株蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）SA38可明显抑制家禽白痢沙门氏菌（Salmonella pullorum）和霍乱沙门氏菌（Salmonella choleraesuis）的生长[46]. 阮丽芳等还发现蜡状芽孢杆菌还可提高苏云金芽孢杆菌对棉铃虫的毒力[47]. 环状芽孢杆菌（Bacillus circulans）是硅酸盐细菌中的常见菌种，它能分解土壤硅酸盐矿物质，使土壤中难溶性钾、磷、硅等转变为可溶性物质供植物生长利用，同时也可产生多种生物活性物质促进植物生长[48,49].
芽孢杆菌是一类应用广泛、安全性高、抗逆性强、环境友好的细菌. 其中许多菌株对多种植物病原菌和害虫有强烈的抑制和杀灭作用，可提高作物的成活率和农产品产量[22~26,36]；一些菌株能分泌纤维素酶降解秸秆类农业废弃物，有利于自然界碳素的循环[27]；具有固氮特性的芽孢杆菌可提高土壤中氮素的含量，促进作物生长[28]；某些芽孢杆菌对有机磷农药具有较高的解磷率，对缓解目前大量施用有机磷农药造成的农业生产环境恶化有积极意义[32]. 随着研究的深入，芽孢杆菌将在生物有机肥的研制和施用中占据越来越重要的地位.
1. 2. 假单胞菌
假单胞菌属是薄壁菌门假单胞菌科的模式属，具有分布广泛、繁殖快、环境适应性强等特点[50]. 其中，荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）属于植物根围促生细菌（PRPG）类，能对多种植物病原菌产生抑制作用而得到广泛的研究[51]. P. fluorescens 96. 578能产生环形脂肽，对立枯丝核菌引起的水稻病害有较好的抑制作用[52]. P. fluorescens JKD-2对稻瘟病的抑制率可达60%[53]. 某些P. fluorescens产生的植物保护素、双萜、多聚物等小分子物质能诱导植株对病原菌产生抗性[54]. Van Peer等用P. fluorescens WCS417处理香石竹后诱导植株产生对尖孢镰刀菌的抗病性[55]. 李萍等报道棉花植株经内生P. gladioli D-2251诱导后植株表面蚜虫数量降低了74.95%[56].
P. fluorescens在环境保护和污染修复等方面也有广泛的应用. Harwood等发现沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonas palustris）在厌氧条件下通过苯甲酰辅酶A途径代谢芳香烃化合物，使芳香环逐个脱落，最终使环完全裂解[57]. 聂麦茜等从污染污泥中分离的假单胞菌PCB2对蒽和菲的混合体系最高TOC去除率可达73.7%[58]. 王松文等报道一株假单胞菌AD1对阿特拉津（atrazine）污染土地有良好的修复作用，30d的处理时间内对阿特拉津最高去除率可达70%[59]. 菌株AEBL3对有机农药呋喃丹污染土壤中呋喃丹的去除率最高可达90%[60]；菌株DLL-1对土壤中残留的农药甲基对硫磷（M-1605）有明显的降解作用，接种DLL-1的土壤在两天后已检测不到M-1605的残留，而对照土壤12天后才达到同样效果[61].
假单胞菌是植物根围促生细菌（PRPG）中一类重要菌种，既能抑制多种植物病原菌的生长，还能分泌一些小分子物质诱导植株产生抗病性，从而能间接提高作物产量. 同时，假单胞菌对农药污染的土壤有较好的修复作用，有利于土壤微生物群落正常功能的恢复和维持.
1. 3. 链霉菌
放线菌是一类具有分枝状菌丝体，高G+C含量，革兰氏阳性细菌，广泛存在于不同的自然生态环境中，种类繁多，大多数菌种可产生多种生物活性物质，如抗生素，是一类具有广泛实际用途和巨大经济价值的微生物资源[62]. 链霉菌是放线菌中一个重要的属.
目前广泛应用的一种放线菌活体制剂Mycostop，可防治一些常见的土传病原菌，如腐霉菌（Pythium），镰刀菌（Fusarium），疫霉菌（Phytophthora）和丝核菌（Rhizoctonia）等引起的土传植物病害. 它还可用于抑制温室中观赏植物和蔬菜上一些常见的病害[63]. 阎淑珍等将分离到的一株链霉菌R-2配制成微生物肥料，田间实验表明，该肥料对棉花黄萎病、油菜菌核病的抑制率分别为72%、97.2%[64]. 我国自上世纪50年代开始使用细黄链霉菌乳糖变种（5406菌肥），在小麦、蔬菜、烟草、人参等多种作物上使用的结果表明其能促进作物生长，提高产量并具有一定抗病、驱虫作用[65]. 胡江春等应用细黄放线菌MB-97克服重茬大豆连作的障碍. 经过试验，MB-97对大豆根际致害生物紫青霉菌的抑制率达80%，对土传真菌病害如镰刀菌的抑制率达50%以上；还可调节优化大豆根际土壤微生物群落，使大豆平均增产15.2%，表明MB-97是一株优良的植物根际促生菌[66]. 峥嵘研究了细黄放线菌5406对小麦生长的影响，发现5406可使小麦地上部分干重增加2.64%，根干重增加21.20%，幼苗根系活力提高11.56%[67]. 刘克锋等报道细黄链霉菌对猪粪和垃圾发酵腐熟效果最好，同时除臭效果最明显[68]. 另外，多种放线菌还有优良的固氮功能，具有固氮能力强，固氮持续时间长等特点[69,70]. 联合国粮农组织（FAO）在马拉维、赞比亚等国推广豆科树木的根瘤菌接种剂和非豆科树木如木麻黄的弗氏固氮放线菌接种剂，接种效果良好[71].
其它放线菌菌株也具有成为生物有机肥中功能菌的潜力. 陈华保等分离一株放线菌IPS-54，其代谢产物对烟草赤星病菌、马铃薯干腐病菌、玉米大斑病菌等病原真菌的菌丝生长抑制率均在80%以上，盆栽试验表明对小麦白粉病菌的保护和治疗作用均大于70%；大田防治番茄灰霉病菌的防效在50%以上[72]. 中国科学院成都生物所胡厚芝等分离的诺尔斯链霉菌西昌变种产生的宁南霉素可诱导植物产生PR蛋白，这种蛋白能降低植物体内病毒粒体浓度，破坏病毒粒体结构，从而达到防治作物病毒病的目的. 它对烟草等作物的病毒病防效最高可达90%以上[73].
4. 其它菌种
固氮菌，溶磷菌，光合细菌等也是生物有机肥中重要的功能菌. 固氮菌是一类通过固氮酶的催化将氮气还原为氨的细菌，是土壤生态系统氮素循环的关键因素，为作物的生长提供必不可少的氮源[74]. 接种了固氮菌的堆肥中全氮增加了11%[75]. 固氮菌可使红海榄幼苗的苗高增加27.3%，地下生物量增加28.8%，地上生物量增加19.4%[76].
溶磷菌具有将植物难利用的磷转化为可利用形态磷的能力，包括细菌、真菌和放线菌等[77]. 杨慧等分离到一株草生欧文氏菌变种P21，对磷酸三钙，羟基磷灰石，磷酸铁，磷酸锌均有较好的溶解作用，其中对磷酸三钙，羟基磷灰石的每升液体培养基溶磷量达1206.2 mg和529.67 mg[78]. 固氮菌和溶磷菌联合对红海榄施用后对其苗高，地下生物量，总生物量，根全氮含量，根全磷含量分别提高43.3%，44.8%，29.9%，29.3%，27%和16.8%[76].
光合细菌是一类利用太阳能生长繁殖的微生物，以H2S或有机物为供氢体还原CO2，并具有固氮功能[79]. 田间实验表明，施用含光合细菌的有机肥能提高小麦，番茄，萝卜等作物的产量，还可提高农产品的品质[79~81]. 在生物有机肥中加入光合细菌，能促进稻田土壤中固氮菌和放线菌的增殖，提高土壤中微生物总量，为作物创造出良好的生长环境[79].
2 生物有机肥中功能菌的安全性问题[82~84]
以基因工程技术为代表的现代生物技术在解决人类社会所面临的粮食短缺、环境污染等重大问题上发挥了巨大作用，然而基因工程技术潜在的巨大风险同样不能忽视. 生物安全问题成为国际社会关注的焦点之一. 生物有机肥中功能微生物的安全性问题也受到各方面的重视. 中国农业部制定的生物有机肥标准（NY 884-2004）中明确指出，生物有机肥中使用的微生物菌种应安全、有效，有明确来源和种名；农业部发布的微生物肥料生物安全通用技术准则（NY 1109-2006）明确规定生物有机肥中使用的菌种安全性分级以及对菌种和产品进行毒理学试验的原则、程序、方法和结果评价指标，成为生物有机肥生产和使用的标准. 然而随着基因工程技术及新菌种逐渐应用于生物有机肥的生产和研制中，生物有机肥中功能微生物的安全性问题需要得到进一步研究和关注，相关法规需要进一步完善.
3 存在问题及发展前景
我国目前使用的各种生物有机肥中固氮菌类基本都是无芽孢菌. 由于无芽孢菌抗逆性差，不耐高温和干燥，成本较高，不易贮存，运输和施用较困难，难以形成规模化生产. 因此，选用能形成芽孢的功能菌有利于生产粉状或颗粒状生物有机肥，方便贮存和运输[6,85].
生物有机肥具有成本低，效率高，无污染，原料来源广泛等优点，符合现代生态农业可持续发展的特点[6]. 生物有机肥代替部分传统化肥及有机农药，可缓解它们对农业生产环境及人体健康的严重危害，合理施用生物有机肥是我国农业实现可持续发展的重要途径[7]. 今后应进一步加强选育高效微生物菌种，改良有机肥原料组成的研究，不断完善原料处理工艺、生产工艺及施肥技术. 可以预见，生物有机肥将在我国农业生产中发挥其特有的经济和生态效益[4,6]. |
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